Les tests de dépistage et sérologiques

- Les tests biologiques ou bilans sanguins comprenant plusieurs types (bilan hématologique, biochimique, lipidique, hépatique, hormonaux, etc) qui mesurent la concentration sanguine de divers éléments selon les besoins (hématies, eucocytes, hormones, protéines, agent infectieux, etc.)

- Les tests sérologiques qui analysent le sérum, c'est-à-dire le sang débarrassé des cellules sanguines et certains éléments afin d'évaluer les niveaux d'immunité (la quantité d'anticorps) selon les pathogènes ciblés.

Les tests sérologiques comprennent plus de 1500 tests (cf. Les Laboratoires Réunis) diférents regroupés en une trentaine de catégories allant de l'hématologie cellulaire de base, à la biochimie en passant notamment par les infections, les toxiques et la bactériologie des différents systèmes biologiques humains.

Des centaines de nouveaux tests sérologiques ont été développés au cours des dernières décennies. Au 1 mai 2023, en France le Ministère de la Santé avait approuvé 694 tests sérologiques rien que pour le Covid-19 (contre 170 tests le 1 mai 2021).

Depuis longtemps les tests sérologiques sont des outils essentiels dans la gestion des maladies infectieuses, y compris le diagnostic de l'infection, les mesures des titres d'anticorps protecteurs lors de la vaccination et les évaluations de la séroprévalence de l'immunité dans une population.

Ces tests utilisent différentes plates-formes, y compris des tests de liaison tels que des tests immuno-enzymatiques IgM et IgG (ELISA), des tests d'écoulement latéral ou des tests basés sur Western blot. De plus, les tests fonctionnels qui testent la neutralisation du virus, l'inhibition enzymatique ou les tests bactéricides peuvent également informer sur les réponses immunitaires médiées par les anticorps.

Ces tests sont efficaces pour détecter des maladies transmises par des vecteurs aussi différents que les bactéries (brucellose, chlamydioses, legionellose, mucoplasmes, salmonelloses, ...), les virus (hépatites, rougeole, rubéole, tétanos, polio, syphilis, VIH, SARS, Covid-19, ...), les parasites (amibiase, echinococcose, cysticercose, toxoplasmose, trichinose, leishmaniose, ascaridiose, ...) et les infections fongiques (mycoses, aspergillose, sporotrichose, ...).

La seule limitation du test sérologique est sa sensibilité qui dépend du moment où le dépistage est effectué. En effet, il ne sert à rien qu'une personne saine demande un test sérologique. Pour qu'il soit efficace, la personne doit avoir développé les anticorps spécifiques. Or la séroconversion (la période de temps nécessaire pour que les anticorps apparaissent en quantité suffisante dans le sang pour être doser) par le système immunitaire n'est mesurable qu'au terme de la période d'incubation du virus. On y reviendra.

Si on utilise par exemple le test de la société NG Biotech installée en Bretagne, selon Thierry Naas, co-directeur du Centre National de Référence de la Résistance aux antibiotiques qui participa à l'évaluation des tests de NG Biotech, "on constate que le jour de l'apparition des symptômes, la sensibilité est nulle. Après 5 jours, elle passe à 10% et après 10 jours à 70%. On dépasse 95% de sensibilité deux semaines après l'apparition des symptômes".

Dans le cas du Covid-19, on ne peut donc réaliser le test sérologique qu'entre le 10^e et le 14^e jour après l'apparition des premiers symptômes. Le réaliser plus tôt ne donnera qu'un résultat négatif et au mieux un résultat douteux.

Bien que les tests sérologiques soient "fiables", selon le type de test il y a encore entre 1 et 5% de faux positifs soit autant que la population auto-immunisée d'un pays comme la France ou la Belgique.

Cela signifie que si un patient est positif au test, sachant que la maladie peut se développer en quelques jours, il doit subir des analyses complémentaires pour identifier les éventuels symptômes liés à l'infection et être suivi par un médecin.

Les tests sérologiques présentent aussi une certaine spécificité (à reconnaître le bon marqueur) variant entre 90 et 100%. Certains tests sont donc plus performants que d'autres alors que leur prix d'usine est pratiquement équivalent.

A part le test rapide qui ne demande qu'une goutte de sang, généralement 2 ml de sérum suffisent pour réaliser l'analyse. En général, une analyse de sang complète demande 5 tubes de prélèvement sanguin soit 25 ml de sang.

Rappelons que certains examens doivent être réalisés à jeun (ne rien avoir mangé depuis 12 heures) tels que la glycémie, le bilan lipidique, le dosage du cholestérol et des triglycérides, les analyses d'allergologie et certaines analyses spécialisées. Pour préserver l'échantillon, il doit être conservé entre 2-8°C maximum et si possible à -20°C. Selon les virus et la technologie d'analyse, le délai pour obtenir les résultats varie entre 10 minutes et 2 heures pour le Covid-19 (cf. O.Schwartz et al., 2020).

La majorité de ces tests sont développés et certifiés en Chine et aux Etats-Unis contre une poignée seulement en Europe (Allemagne, France, Belgique, Pays-Bas), ce qui explique le retard qu'ont pris les pays européens pour tester et dépister les personnes symptomatiques durant la pandémie de Covid-19.

Il existe deux tests immuno-enzymatiques ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay signifiant Dosage immuno-enzymatique). Le premier nommé ELISA N utilise comme antigènes cibles la protéine N entière du Covid-19. Le second nommé ELISA S utilise le domaine extracellulaire de la protéine S, c'est-à-dire la partie de la protéine située à l'extérieure de la membrane plasmique, ce qu'on appelle le domaine de liaison au récepteur (RBD). Le test ELISA S est un peu plus sensible que l'ELISA N. On reviendra sur le test ELISA ou WESTERN BLOT à propos des maladies de la peau.

Un test ELISA sur plaque de micro titration de 96 cupules après l’ajout du substrat mais avant la fin de la période d’incubation (à gauche). Une réaction de coloration révélée par un substrat de la peroxydase (TBM) est interrompue par de l'acide qui fait passer le substrat du jaune au bleu (à droite). La coloration est proportionnelle à la concentration du produit biologique fixée dans chaque cupule de la plaque (voir schéma plus bas). Documents S.Lang.

Ces deux tests ont l'avantage d'utiliser une technique simple facilement transposable dans des kits commerciaux très compacts comme on le voit ci-dessous. En théorie, ces deux tests peuvent être utilisés à grande échelle et être industrialisés, ce que certains pays ont déjà fait après évaluation de leur efficacité.

Des variantes du test ELISA ont été développées pour une utilisation sur le terrain plutôt qu'en laboratoire. Ainsi, des tests à flux latéral dit à "bandelettes" permettent de rapidement détecter de nombreux virus pathogènes, certaines bactéries et champignons. Ces tests présentent l'avantage d'afficher le résultat en quelques minutes et de présenter une bonne sensibilité. Ils permettent de confirmer sur place un diagnostic médical basé sur l'observation de symptômes. Par contre, la quantité de tissu testé est très faible et le coût est élevé, ce qui limite leur usage si le test est destiné à l'analyse de pathogènes distribués de façon hétérogène dans une population, qu'elle soit animale ou autre.

Les tests ELISA et de flux latéral sont effectués avec des antigènes recombinants, tels que la protéine S du Covid-19, le domaine de liaison au récepteur (RBD) qui fait partie de la protéine S, ou la nucléoprotéine virale. Ces tests peuvent être manipulés dans un laboratoire de virologie de niveau de biosécurité P2 et peuvent donc être largement utilisés étant donné la nature recombinante des antigènes sélectionnés.

A gauche, une chaîne de fabrication de kits de tests pour le Covid-19 chez SD Biosensor installée près de Cheongju, en Corée du Sud. Ils fournissent notamment l'Allemagne et l'Italie. Des kits similaires pour le VIH et la Syphilis ont déjà été évalués favorablement par la Belgique, l'Allemagne, le Congo et d'autres pays. Document AFP/Gulf News. A droite, un kit sérologique rapide pour le Covid-19 développé par Biomedomics. Résultat à domicile en 10 minutes avec une sensibilité de 89% et une spécificité de 91%. Ce test est notamment utilisé par le CDC en Chine. Il n'est pas encore validé par la FDA bien qu'elle ait accepté son usage d'abord par les chercheurs puis par les laboratoires d'analyses officiels. Ce test a reçu la certification européenne CE Mark-IVD et fut utilisé en Italie au plus fort de la pandémie.

Il s'agit d'un test sérologique détectant la protéine S du Covid-19 dans sa conformation naturelle, à la surface de la cellule. Il donne des résultats similaires à ELISA S avec une sensibilité supérieure lorsque les taux d'anticorps sont faibles. En revanche, le test nécessite un système de lecture particulier appelé un cytomètre de flux (dans lequel l'échantillon défile devant un faisceau laser) qui est moins répandu dans les laboratoires d'analyse que le lecteur de plaques de titration. Il est donc plus adapté à des activités de recherche épidémiologique plutôt qu'au diagnostic de la population.

Il s'agit d'un test sérologique utilisant une technique différente des test précités. Il utilise l'immunoprécipitation luciférase (les protéines virales sont marquées par fluorescence) pour détecter les anticorps se fixant sur la protéine N ou S du Covid-19 ou leurs sous-domaines (par exemple, la partie S1 de la protéine S).

Ce test permet de caractériser de façon précise les régions des protéines virales cibles de la réponse en anticorps. La sensibilité du test varie selon l'antigène détecté. Notons que ce type de test est utilisable sans modification chez la plupart des animaux.

La technique LIPS a déjà été utilisée pour distinguer par exemple les patients grippés infectés et vaccinés en raison de la présence d'anticorps contre les protéines non structurales (nsp) et pour caractériser les infections humaines d'origine zoonotique des virus de chauve-souris.

Dans un article publié dans la revue "Nature Immunology" en août 2020, des chercheurs ont annoncé avoir découvert que les anticorps ORF8 et ORF3b sont des cibles majeures de la réponse immunitaire au Covid-19 et peuvent être utilisés pour des tests plus spécifiques du Covid-19. Pour rappel, ORF8 et ORF3b sont respectivement des marqueurs sérologiques précis de l'infection précoce (96.5% de spécificité) et tardive (99.5% de spécificité) du Covid-19.

Ces résultats encourageants pourraient être utilisés pour développer des tests de diagnostic de deuxième génération pour améliorer les tests sérologiques du Covid-19 et sont importants pour comprendre la pathogénicité, c'est-à-dire la capacité du virus à déclencher la maladie.

Le test VNT (Virus Neutralisation Test) utilise une dose fixe de virus qui détruit la totalité des cellules. Le but est de déterminer si la présence d'anticorps anti-Covid-19 permet de neutraliser le virus et donc d'empêcher la destruction des cellules.

Ce test permet de savoir exactement si, quand, comment et combien d'anticorps spécifiques (anticorps neutralisants NAb voire d'autres) ont neutralisé le virus.

Le test VNT est très important car les experts sont encore confrontés à des inconnues. Ils doivent notamment comprendre pourquoi des patients ont rechuté et ils connaissent encore mal la contagiosité du virus ainsi que tous les symptômes qu'il engendre et à quel moment. Le test de neutralisation est donc privilégié, y compris pour le développement d'un traitement basé sur les anticorps antiviraux.

Le test VNT est assez lourd et onéreux car il nécessite une manipulation en laboratoire de niveau P3, ce qui limite son application. De manière générale, la sensibilité du test de neutralisation dépend fortement des différences antigéniques entre l'isolat viral utilisé dans le test et le virus qui a induit les anticorps. Soulignons que ce n'est pas un test de diagnostic de routine. Il n'est pas normalisé entre les laboratoires.

Des alternatives plus sûres et à plus haut débit adaptés aux virus infectieux sont en cours de développement et incluent l'utilisation d'analyses de particules virales pseudotypées, dans lesquelles la protéine S du Covid-19 est greffée sur des virus inoffensifs ou des particules de type viral, comme le test Lenti S.

Ce test utilise non pas le Covid-19 mais un pseudovirus non infectieux. Ce test n'exige pas de conditions de sécurité élevées ce qui permet de l'utiliser à grande échelle.

A l’inverse des tests de type ELISA qui détectent la présence d'anticorps, le test de séro-neutralisation mesure la capacité des anticorps à bloquer l'entrée du virus dans les cellules. Actuellement, ce test est rarement utilisé car il n'est pas adapté au très haut débit et on ignore encore la quantité d'anticorps neutralisants nécessaire pour assurer une protection efficace ainsi que leur persistance dans le temps. Toutefois des études sont en cours.

Mais pour utiliser ces différents tests sérologiques, il faut disposer des anticorps à large spectre ou spécifiques. Fin mars 2020 peu de pays en avaient pour le Covid-19. De plus, jusqu'à présent le résultat est plus long à obtenir qu'un simple test PCR mais ce délai a déjà été raccourci (voir plus bas).

Le test sérologique "DBS" (Dry Blood Spot) consiste à déposer quelques gouttes de sang sur un buvard. Une fois sec, l'échantillon est ensuite conservé à -20°C ou plus bas (sinon à -4°C durant 14 jours maximum) puis préparé sous forme d"éluat pour analyse.

Le test peut être simplifié. Le patient ne doit pas obligatoirement se rendre chez son médecin, ni dans un laboratoire où à l'hôpital pour effectuer une prise de sang, ni subir une piqûre dans le bras. Il peut réaliser le prélèvement chez lui en se piquant le bout du doigt à l'aide d’une lancette. Il recueille quelques gouttes de sang sur un support absorbant puis l'envoie par la poste au laboratoire chargé de l'analyser.

Le test DBS peut-être utilisé en drive-in. La personne invitée à se faire tester connaîtra le résultat moins de 24 heures plus tard.

Techniquement, comme l'explique Nico Grüner et ses collègues dans une illustration publiée dans le journal "JoVE Biology" en 2015 présentée à droite, le sang est prélevé par une lancette (A). Les gouttes de sang sont ensuite transférées aux cercles d'une carte de filtre de Grade 903 (cf. EBF) pouvant contenir 75 à 80 μl de sang (B, C).

Les échantillons sont séchés à température ambiante sous une hotte jusqu'à former des taches uniformes d'une couleur brunâtre (D).

Les nouvelles techniques (mais qui existent déjà depuis les années 1960 pour le dépistage néonatal) permettent d'utiliser du papier buvard et de ne prélever que quelques microlitres de sang (cf. Hemaxis).

Lorsque les taches de sang sont sèches, les échantillons sont stockés au froid dans des sacs imperméables et déshydratés (E).

On prépare ensuite l'échantillon (F, G) puis on le place sur un agitateur (H). On récupère ensuite les éluats (I) et enfin on les centrifuge (J) pour libérer les éluats DBS de tout débris qui pourrait s'être formé au cours du processus d'élution (K).

Les éluats DBS sont prêts pour analyse par une plate-forme entièrement automatisée (L) afin de détecter le marqueur sérologiques de l'éventuelle infection. Il existe aujourd'hui des marqueurs pour l'hépatite B, l'hépatite C, le VIH, le paludisme, le Covid-19, etc.

Aujourd'hui il existe des analyseurs sérologiques portatifs ou de poche qui fournissent rapidement au patient un résultat sous forme de code barre exprimant l'abondance des immoglobulines IgG et IgM, c'est-à-dire les titres d'anticorps produits par le système immunitaire. La première barre, C sert de contrôle. La deuxième barre indique si les IgG sont positifs et la troisième barre indique si les IgM sont positifs.

- L'IgM indique si la personne a développé rapidement ces immoglobulines au contact d'un pathogène. Leur présence indique une infection en cours, mais leur abondance diminue avec le temps.

- L'IgG indique si l'organisme a développé ces immoglobulines au contact d'une infection plus ancienne, un an ou plus, et a conservé des anticorps pour s'en protéger. Il représente donc la mémoire des infections. Une valeur positive au Covid-19 chez un porteur sain signifie qu'il est immunisé.

En combinant ces résultats (en admettant qu'ils ne sont pas douteux), on obtient 4 situations possibles :

- IgM négatif et IgG négatif : Pas d'infection ou pas d'anticorps détectables pour le Covid-19.

PCR	Anticorps totaux	IgG	Contagiosité	Immunité*	Conclusion
-	-		Non	Non	Pas de contact avec le virus en dehors d'un risque d'exposition il y a moins de 5 jours
-	+	-	Possible	Peu probable	Résultats compatibles avec une infection récente ou la présence d’anticorps non spécifiques. Le résultat négatif de la PCR peut être lié à un prélèvement non contributif
-	+	+	Peu probable	Oui	Résultats compatibles avec une infection récente en cours de séroconversion. Le résultat négatif de la PCR peut être lié à un prélèvement non contributif - un contact ancien avec le Covid-19
+	-		Oui	Non	Résultats compatibles avec une infection aiguë par le Covid-19
+	+	-	Oui	Peu probable	Résultats compatibles avec une infection aiguë par le Covid-19
+	+	+	Oui	Probable	Résultats compatibles avec une infection par le Covid-19 en cours de séroconversion
* Au moins à court terme, en l’absence de mutation du virus. Source: Bionext.

Dans le cas du Covid-19, la séroconversion en anticorps IgA apparait entre 3 et 6 jours après le début des symptômes. De faibles taux peuvent être liés à des réactions aspécifiques. De plus, les déficits en IgA sont relativement fréquents dans la population. La recherche d'anticorps IgA de manière isolée n'est donc pas recommandée. La séroconversion en IgM est à son maximum au bout de 2 ou 3 semaines et celle en IgG au bout de 3 à 6 semaines après le début des symptômes. L'apparition chronologique des IgM et des IgG est très variable de sorte que la détection des IgG seules n'est pas recommandée pour une interprétation des résultats dans la période épidémique actuelle.

Le test sérologique permet de vérifier si la charge virale est toujours présente ou si la personne a fabriqué des anticorps et certains types de cellules T. Cette analyse permet d'identifier les personnes qui sont encore sensibles au virus et celles qui ne sont plus contagieuses du fait que la charge virale est indétectable. Elle permet aussi d'identifier les personnes immunisées qu'on pourrait séparer de la population potentiellement à risque et confinée, les autoriser à sortir du confinement.

Le test sérologique est donc intéressant à plus d'un titre. A condition que les données soient rapidement enregistrées et injectées dans des modèles épidémiques, du point de vue épidémiologique et donc à l'échelle collective, il permet d'identifier le pourcentage de personnes qui ont été infectées jour après jour. Les analyses qui en découlent permettent aux experts en sécurité sanitaire de calculer le risque et de réaliser des simulations précises afin de déterminer l'état sanitaire d'une population. Cela permet au gouvernement de savoir si les conditions sanitaires permettent par exemple de lever le confinement ou de concentrer les efforts sur des populations résidant par exemple dans des foyers actifs. Ces tests permettent aussi indirectement de calculer les taux de contamination et de létalité.

Nous savons que la salive transporte des microbes et la langue notamment en abrite de nombreuses espèces. Mais on connaît peu de chose sur son aspect immunologique. Dans le cadre de la pandémie de Covid-19, Jennifer L. Gommerman de l'Université de Toronto, au Canada, et ses collègues ont étudié la réponse en anticorps dans la salive et sa relation avec les niveaux systémiques d'anticorps. Les chercheurs ont montré qu'on pouvait appliquer les tests immuno-enzymatiques (ELISA) pour mesurer les réponses IgG, IgA et IgM à la protéine S du Covid-19 et à son domaine de liaison au récepteur (RBD) dans le sérum et la salive des patients aigus et de convalescents diagnostiqués en laboratoire entre 3 et 115 jours après l'apparition des symptômes (PSO). Leurs résultats furent publiés dans la revue "Science" le 8 octobre 2020.

Les réponses des anticorps anti-Covid-19 ont facilement été détectées dans le sérum et la salive, les pics d'IgG étant atteints après 16 à 30 jours après le PSO. Si les anticorps IgA et IgM se désintégraient rapidement, les anticorps IgG restaient relativement stables jusqu'à 105 jours de PSO dans les deux biofluides. Enfin, les réponses IgG, IgM et dans une moindre mesure IgA à la protéine S et au RBD dans le sérum étaient corrélées avec les échantillons de salive.


Analyse transversale des réponses IgG, IgA et IgM à la protéine S et aux antigènes RBD du Covid-19 dans le sérum (gauche) et dans la salive (droite). Les immunoglobulines indiquées ont été profilées par le test ELISA chez des candidats pré-Covid, des patients Covid hospitalisés atteints d'une infection aiguë et des patients convalescents. Documents J.Gommerman et al. (2020).

Selon les chercheurs, "cette étude confirme que les anticorps IgG sériques et salivaires anti-Covid-19 sont maintenus chez la majorité des patients Covid pendant au moins 3 mois après l'apparition des symptômes. Les réponses IgG dans la salive peuvent servir de mesure de substitution de l'immunité systémique au Covid-19 sur la base de leur corrélation avec les réponses IgG sériques".

Début janvier 2021, en France il existait 54 tests PCR différents et 51 tests sérologiques dont voici la liste maintenue par le ministère de la Santé.

Notons qu'on peut également acheter des tests antigéniques salivaires en ligne, par exemple chez Praxidienst. Il revient à ~5.5 € pièce.

Si les tests sérologiques sont importants pour comprendre la réponse immunitaire, il reste des questions en suspens. Par exemple, toutes les personnes infectées présentent-elles suffisamment d'anticorps pour répondre à l'infection au Covid-19 ?

Nous verrons que les spécialistes n'ont pas systématiquement constaté de différence dans la proportion d'anticorps produite chez les patients Covid en phase asymptomatique, légère ou sévère. On sait juste que sans vaccination la réponse en anticorps ne dépasserait pas 3 à 8 mois. Mais on ne sait pas si la présence d'anticorps de liaison sur les protéines S ou sur les antigènes RBD est en corrélation avec la neutralisation du virus. S'il y a bien un pic de réponse des anticorps dans les deux mois qui suivent la vaccination, la corrélation entre les titres d'anticorps (liants ou neutralisants) et la protection contre la rechute n'est pas encore très claire.

En revanche, depuis les campagnes de vaccination en 2020, on connait les seuils minima d'anticorps pour lutter efficacement contre le Covid-19 (cf. la question 3 dans l'effet de la vaccination en 10 questions). Ces données sont importantes pour déterminer les caractéristiques et l'efficacité des vaccins.

Des analyses quantitatives ou binaires peuvent être utilisées pour ces études. Les analyses quantitatives peuvent fournir des résultats plus fiables (par exemple, des tests ELISA en deux étapes), mais ils sont également plus difficiles à mettre en oeuvre car ils doivent souvent être effectués dans des laboratoires spécialisés. En revanche, les tests binaires (par exemple, les tests de flux latéral) peuvent facilement être mis en œuvre car ce sont souvent des tests réalisables par de petits laboratoires d'analyses.

Les analyses des résultats des dépistages sérologiques doivent tenir compte de la sensibilité et de la spécificité du test utilisé ainsi que de la prévalence estimée des infections dans les diférentes populations. De plus, les variables biologiques résultant d'une caractérisation approfondie des réponses immunitaires comme la durée des réponses immunitaires et la nature dynamique des titres d'anticorps du Covid-19 liés aux formes asymptomatiques, légères et sévères doivent être prises en compte dans le calcul de la prévalence sur base des dépistages sérologiques. Actuellement, dans la plupart des pays bon nombre de ces variables critiques sont inconnues. Par conséquent, toutes les analyses sérologiques effectuées en 2020 ont dû être interprétées avec prudence.